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          技術專欄

          ELK Biotechnology總結Elisa實驗中細胞樣本的制備與保存
          供稿:市場部發布時間:2022-12-13瀏覽量:244次

          細胞培養上清

           ?、賹⒓毎囵B上清液吸入離心管中,在2-8℃下以1000×g離心20分鐘,除去細胞碎片和雜質,收集上清液備用,

           ?、跇颖颈4嬖?20℃或-80℃,避免反復凍融。

           

          0uniprot

          Q:那什么情況下需要測細胞裂解液,什么情況下是檢測細胞培養液上清呢?

          A:首先從細胞培養的形態(貼壁細胞、懸浮細胞)所檢測蛋白分泌表達位置:

          在uniprot蛋白數據庫中Subcellular Location 欄目可查到該蛋白的分泌表達部位

           例1:mouse  白介素6的分泌表達位置,細胞質,質膜,胞外表達。

          一、勻漿介質(量)
           

          一般采用0.05mol/LTris-HCl,pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據樣本及測定指標的情況自行設定濃度,目的是保持樣本的等滲環境。

           
          二、細胞樣本的前處理:
           

          1、細胞沉淀的收集:

          ①懸浮細胞:對于懸浮培養的細胞,直接通過離心收集細胞沉淀,將培養液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘,棄上清留細胞沉淀。

          ②貼壁細胞:對于貼壁培養的細胞,用胰酶將細胞消化下來,或用細胞刮將細胞刮下來,將培養液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘,棄上清留細胞沉淀。

          我們一般建議客戶,細胞密度不要小于106個/ml。

          2、細胞沉淀的洗滌:

          在細胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS(等滲),輕輕顛倒混勻,將培養液在室溫條件下1000轉/分,離心10分鐘,棄上清留細胞沉淀。重復上述操作反復洗滌1~2次。

           
          三、勻漿的方式:
           

          手工勻漿,超聲破碎,裂解液裂解,反復凍融。

          ①手工勻漿:在細胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據所測指標的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細胞懸浮于PBS中,用移液器將細胞懸浮液移至玻璃勻漿管中(2ml玻璃勻漿管),將玻璃勻漿管置于冰水混合物中,手動勻漿3分鐘,然后取破碎好的細胞懸浮液進行測定。

          ②超聲破碎:

          在細胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據所測指標的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細胞懸浮于PBS中,在冰水浴條件下進行如下操作:

          a、用超聲粉碎機進行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎,也可用國產超聲波發生儀,用400安培,5秒/次,間隙10秒反復3~5次。

          b、用超聲細胞破碎儀,300W功率,每次超聲3~5秒,間隔30秒,重復4~5次。

          ③裂解液裂解

          常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的,或者說作用力量強弱不同。

          1、SDS屬于離子型去垢劑,效果最強,基本可以把細胞核膜破壞掉,DNA會釋放出來,裂解液變得很粘稠。

          2、NP-40是很溫和的去垢劑,1%濃度的基本可以破壞掉胞膜,而對核膜破壞的作用弱,結合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。

          3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間,偏向于NP40,也是常用的細胞裂解液成分之一,在保護蛋白活性方面有一定作用(SDS基本會使蛋白變性失活)。

          去垢劑屬性只是一方面,buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關鍵因素

          由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對酶活力的測定有一定的影響,一般不推薦用裂解液進行裂解。

          ④反復凍融:

          在細胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根據所測指標的不同而有所改變,一般加入0.5ml,細胞密度不小于一百萬個/ml),混勻,將細胞懸浮于PBS中,放低溫冰箱中結冰,溶解,再結冰,再溶解,反復3次左右)。由于反復凍融對酶活力影響較大,一般使用生化法測酶活時不能使用。

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